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簡要描述：MICH TLX DNA建庫試劑盒是為illumina平臺設(shè)計(jì)的 DNA 文庫準(zhǔn)備試劑盒，適用于起始量1 ng-200 ng 的 DNA 樣本，試劑盒經(jīng)過精心設(shè)計(jì)和優(yōu)化，能夠快速構(gòu)建文庫（2.5-3.5小時），有高效的文庫轉(zhuǎn)化率與擴(kuò)增效率。
產(chǎn)品型號：NGS 0602-96廠商性質(zhì)：生產(chǎn)廠家更新時間：2024-06-28訪 問 量：2972詳細(xì)介紹
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 主要用途 | 用于DNA建庫。 |
|---|---|---|---|
| 應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,制藥/生物制藥 |
MICH TLX DNA-seq kit (illumina Compatible)
MICH TLX DNA建庫試劑盒 #NGS 0602-96(96 rxns)
MICH TLX DNA-seq kit (illumina Compatible) 是為 illumina 平臺設(shè)計(jì)的 DNA 文庫準(zhǔn)備試劑盒， 適用于起始量 1 ng-200 ng 的 DNA 樣本，試劑盒經(jīng)過精心設(shè)計(jì)和優(yōu)化，能夠快速構(gòu)建文庫（2.5-3.5 小時），有高效的文庫轉(zhuǎn)化率與擴(kuò)增效率，已經(jīng)經(jīng)過多樣本驗(yàn)證可獲得優(yōu)異的文庫與測序數(shù)據(jù)，可 用于石蠟包埋組織 DNA 樣本建庫。試劑盒包含了 DNA 片段化和末端修復(fù)加 A 尾的預(yù)混液、連接預(yù) 混液、高保真擴(kuò)增預(yù)混液、短接頭和含有 INDEX 的 PCR 引物（可以根據(jù)客戶要求進(jìn)行選配）。
產(chǎn)品組分
TLX Buffer Mix
TLX Enzyme Mix
TLX ligase Enzyme
TLX ligase Buffer
TLX Adapter for ILM
PCR Master Mix
使用方法
磁珠： Cat#A63881，AMPure XP Beads 或其他等效產(chǎn)品。
DNA 質(zhì) 控：Cat#Q33238，life qubit4.0；Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer 或 其 他等效產(chǎn)品。
其他材料：Nuclease-free water、低吸附 EP 管、無水乙醇、TE Buffer（10 mM TrisHCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、磁力架、PCR 管、PCR 儀等。
使用流程
圖1. DNA 文庫準(zhǔn)備流程圖
實(shí)驗(yàn)步驟
片段化 / 末端修復(fù) / 加 A 尾（Fragment/End Preparation/dA-Taling）
1. 將所需試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。
2. 于無菌 PCR 管中配制下表所示反應(yīng)體系。
| 試劑名稱 | 體積 |
| TLX Buffer Mix | 4 μL |
| TLX Enzyme Mix | 3.2 μL |
| gDNA | X |
| Nuclease-free water | Up to 20 μL |
表 1. 片段化 / 末端修復(fù) /dA 尾反應(yīng)體系
3. 吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。
4. 按下表設(shè)置反應(yīng)程序(熱蓋設(shè)置為 82℃) ，將上述 PCR 管置于 PCR 儀中反應(yīng)。
| 溫度 | 時間 |
| 37℃ | 20 min |
| 72℃ | 20 min |
| 4℃ | Hold |
表 2. 片段化 / 末端修復(fù) / 加 dA 尾反應(yīng)程序
接頭連接(Adapter Ligation)
1. 將所需試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。
2. 如下表所示配制反應(yīng)體系。
| 試劑名稱 | 體積 |
| dA-tailed DNA(3.1 步驟產(chǎn)物) | 20 μL |
| TLX ligase Enzyme | 2 μL |
| TLX ligase Buffer | 8 μL |
| TLX Adapter for ILM | 2 μL |
| Nuclease-free water | Up 40 μL |
表 3. 接頭連接反應(yīng)體系(接頭詳細(xì)說明見注意事項(xiàng) 二)
3、吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。
4、將上述 PCR 管置于 PCR 儀中 22℃，孵育 60min。
【注】：當(dāng)投入 DNA 量較低，實(shí)驗(yàn)效果不理想時，可嘗試將連接時間延長。
連接產(chǎn)物磁珠純化(Post Ligation Clean Up)
A. 產(chǎn)物純化操作步驟(必選)
1、準(zhǔn)備工作：將 AMPure XP Beads 室溫平衡 30 min。配制 80% 乙醇。
2、吸取 48 μL AMPure XP Beads (1 .2×，Beads:DNA=1.2:1) 至接頭連接產(chǎn)物中， 渦旋混 勻或移液器吹打 10 次混勻，室溫孵育 5 min。
3、短暫離心并置于磁力架上，待溶液澄清后(約 5 min)，棄上清。
4、保持 PCR 管始終置于磁力架中，加入 200 μL 新鮮配制的 80% 乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，棄上清。
5、重復(fù)步驟 4。
6、保持 PCR 管始終置于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛出現(xiàn)龜裂(約 5 min)*。
7、
1) 如產(chǎn)物無需進(jìn)行片段分選，將 PCR 管從磁力架中取出，磁珠 ( 無需用水洗脫 ) 直接用于文庫擴(kuò)增步驟反應(yīng)。
2) 如產(chǎn)物需進(jìn)行雙輪分選， 加入 52-102 μL Nuclease-free Water，渦旋振蕩或輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置 5 min。將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清 后(約 5 min) ，小心移取 50-100 μL 上清至新 PCR 管中，切勿觸碰磁珠(洗脫體積越大，洗脫效率越高，分選效果越好，詳細(xì)說明見注意事項(xiàng)）。
* 等待磁珠干燥過程中，可配制 文庫擴(kuò)增步驟反應(yīng)體系。
B. 雙輪分選操作步驟(可選)
1、準(zhǔn)備工作：將 AMPure XP Beads 室溫平衡 30 min。配制 80% 乙醇。
2、根據(jù) DNA 片段長度要求，參考表 4 向純化產(chǎn)物中加入第一輪分選磁珠，渦旋混勻或移液 器吹打 10 次混勻。
| 插入 DNA 片段大小 | 150 - 250 bp | 200-300 bp | 300-400 bp | 400-600 bp | 500-700 bp |
| DNA 文庫大小 | 250 - 350 bp | 300-400 bp | 400-500 bp | 500-700 bp | 600-800 bp |
| 第一輪磁珠體積 | 0.70X | 0.65X | 0.62X | 0.48X | 0.44X |
| 第二輪磁珠體積 | 0.25X | 0.25X | 0.16X | 0.16X | 0.16X |
表 4 文庫雙篩對應(yīng)磁珠體積參照表
【注】：表中“0.7×”表示樣品 DNA 體積的 0.7 倍。如文庫插入片段長度為 200 bp，樣品 DNA 體積為 100 μL，則第一輪分選磁珠使用體積為 0.70×100 μL=70 μL；第二輪分選磁珠使用體積為 0.25×100 μL=25 μL。
3、室溫孵育 5min。將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后(約 5 min) ，小 心轉(zhuǎn)移上清到干凈的 PCR 管中。
4、參考表 4 向上清中加入第二輪分選磁珠。渦旋混勻或移液器吹打 10 次混勻，室溫靜置 5 min。
5、 將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后(約 5 min)，棄上清。
6、保持 PCR 管始終處于磁力架中，加入 200 μL 新鮮配制的 80% 乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，棄上清。
7、重復(fù)步驟 6。
8、保持 PCR 管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛出現(xiàn)龜裂(約 5 min)*。
9、將 PCR 管從磁力架中取出，磁珠 ( 無需用水洗脫 ) 直接用于文庫擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。
* 等待磁珠干燥過程中，可配制 文庫擴(kuò)增步驟反應(yīng)體系。
文庫擴(kuò)增(Library Amplification)
1、將表 5 所需試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。
2、如下表所示配制反應(yīng)體系。
| 試劑名稱 | 體積 |
| Adapter Ligated DNA(3.3 步驟產(chǎn)物) | 干燥后的磁珠 |
| PCR Master Mix | 10 μL |
| I7 Primer | 1 μL |
| I5 Primer | 1 μL |
| Nuclease-free water | 8 μL |
表 5 文庫擴(kuò)增反應(yīng)體系
【注】： 含有 Index 的 PCR 引物(i5 Prmier 和 i7 Primer) 信息詳見 MichTM TLX Primer Kit(Catalog #NGS CD-0602-C)說明。
3、將配置好的 PCR 反應(yīng)液加入到 3.3.1 或 3.3.2 步驟完成后的含有磁珠的 PCR 管中， 吹打或 振蕩混勻，并短暫離心。
4、按下表設(shè)置反應(yīng)程序，將上述 PCR 管置于 PCR 儀中反應(yīng)。
| 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
| 98℃ | 2 min | 1 |
| 98℃ | 30 s |
參照注意事項(xiàng)四：關(guān)于文庫擴(kuò)增的表 1 |
| 65℃ | 30 s | |
| 72℃ | 40 s | |
| 72℃ | 4 min | 1 |
| 4℃ | Hold | * |
表 6 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序
產(chǎn)物磁珠純化(Post Amplification Clean Up)
同：產(chǎn)物純化操作步驟。使用 AMPure XP Beads(1×，Beads:DNA=1:1) 純化文庫擴(kuò)增產(chǎn)物， 最后加適量 Nuclease-free water(20-50 μL) 進(jìn)行洗脫(產(chǎn)物如需保存請 使用 TE Buffer 洗脫)。
文庫質(zhì)量控制
通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進(jìn)行質(zhì)量評價，具體請參見：注意事項(xiàng)中的關(guān)于文庫質(zhì)檢。
注意事項(xiàng)
關(guān)于操作
1、請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2、使用前請將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。
3、混勻時請輕輕吹打或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會造成文庫產(chǎn)出下降。
4、為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的一次性槍頭。
5、推薦在帶熱蓋的 PCR 儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR 儀至反應(yīng)溫度附近。
6、請?jiān)跐崈舻膶?shí)驗(yàn)環(huán)境下實(shí)驗(yàn)，避免污染。
TLX Adapter for ILM 說明
1、TLX Adapter for ILM 采用短接頭模式。
2、接頭濃度：15 μM; 直接用于相應(yīng)建庫試劑盒連接體系里即可。
3、-20℃保存，使用前提前融化，盡量低溫融化，避免在超過 30℃的環(huán)境中融化。
4、建庫推薦使用量：常規(guī) DNA 投入量 100-200 ng, 2 μL/rxns；其他 DNA 投入量需要適當(dāng)調(diào) 整接頭使用量。
關(guān)于磁珠純化與分選
1、DNA 片段選擇步驟可在接頭連接后或文庫擴(kuò)增后進(jìn)行。
2、當(dāng) Input DNA 質(zhì)量≥ 50 ng， 建議在接頭連接后分選； 如 Input DNA 質(zhì)量<50 ng， 可在 文庫擴(kuò)增后進(jìn)行分選。
3、TLX Ligase Buffer 包含高濃度的 PEG，對雙輪磁珠分選產(chǎn)生顯著影響。因此，當(dāng)在接頭 連接后進(jìn)行片段選擇，須先進(jìn)行純化步驟，再進(jìn)行雙輪分選步驟；如在文庫擴(kuò)增后進(jìn)行片 段選擇，可直接進(jìn)行雙輪磁珠分選步驟。
4、磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，并混勻再使用，否則會導(dǎo)致得率下降。
5、80% 乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。
6、進(jìn)行片段選擇時， 初始樣品體積應(yīng)盡量≥ 100 μL， 初始樣本體積越大， 片段選擇效果越好。
關(guān)于文庫擴(kuò)增
1、文庫擴(kuò)增循環(huán)數(shù)與文庫產(chǎn)量和文庫質(zhì)量有直接關(guān)系，請參照下表列舉的本試劑盒設(shè)置擴(kuò)增 循環(huán)數(shù)，并摸索合適的循環(huán)數(shù)。
| DNA 投入量 | 獲得 100 ng 文庫需要循環(huán)數(shù) | 獲得 300 ng 文庫需要的循環(huán)數(shù) |
| 250 ng | 1-4 | 5-7 |
| 100 ng | 2-5 | 6-8 |
| 50 ng | 4-7 | 8-10 |
| 10 ng | 6-8 | 9-12 |
| 5 ng | 7-10 | 11-14 |
| 1 ng | 9-11 | 12-15 |
表 1. 文庫擴(kuò)增循環(huán)數(shù)參照表
【注】：如文庫擴(kuò)增后需要做片段選擇時參照較高循環(huán)數(shù)擴(kuò)增。
關(guān)于文庫質(zhì)檢
1、通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進(jìn)行質(zhì)量評價。
2、文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈 DNA 熒光染料的方法， 如 Qubit® 或 qPCR 絕對定量的方法。
3、文庫長度分布檢測，可通過 Agilent Bioanalyzer 2100 等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的 設(shè)備進(jìn)行檢測。
運(yùn)輸與保存方法
-20℃運(yùn)輸。
所有組分 -20° C 保存，有效期 1 年。
MICH TLX DNA建庫試劑盒產(chǎn)品信息
| 產(chǎn)品貨號 | 名稱 | 規(guī)格 |
| NGS 0602-8 | MICHTM TLX DNA-seq kit (illumina Compatible) | 8 rxns |
| NGS 0602-24 | MICHTM TLX DNA-seq kit (illumina Compatible) | 24 rxns |
| NGS 0602-96 | MICHTM TLX DNA-seq kit (illumina Compatible) | 96 rxns |
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